FTIR Mikroskopie

Infračervená mikroskopie, známá také jako FT-IR mikroskopie, je technologie integrující FT-IR spektroskopii s tradiční světelnou mikroskopií. Tato metoda tak umožňuje chemickou analýzu malých struktur a složitějších vzorků. Obzvlášť účinná je při zkoumaní malých částic, nehomogenních vzorků – zkrátka všude tam, kde očekáváme proměnlivé rozložení chemismu v prostoru. Postup analýzy zahrnuje vizuální prohlídku vzorku, pořízení klasických VIS snímků, výběr malé oblasti zájmu a použití FT-IR technologie k získání chemické informace z daného místa (případně identifikaci a kvantifikaci látek).

Infračervený mikroskop pracuje podobně jako FT-IR spektrometr, přičemž využívá interakci IR světla se vzorkem k vytvoření chemického otisku nebo spektra. V závislosti na vzorku se používají různé metody FT-IR analýzy, včetně transmise, reflexe a zeslabené celkové reflektance (ATR).

• Při transmisi prochází IR světlo skrz vzorek a následně je detekováno. Pro použití transmise v FT-IR mikroskopii musí být vzorky obvykle připraveny specifickým způsobem, např. tenkým řezem mikrotomu. Pro transmisní analýzu jsou zpravidla vhodné vzorky o tloušťce pouze několik desítek µm. Pro uchycení vzorku se zpravidla využívají také IČ transparentní sklíčka jako nosné materiály – např. ze KBr, CaF2, BaF2 a dalších.
• Reflektance se používá k analýze pevných materiálů, kdy se IR světlo odráží od povrchu vzorku a poté se detekuje. Můžeme také analyzovat velmi tenké vzorky, které jsou umístěny na reflexním podkladu, jako jsou tenké tkáně nebo povlaky. V takovém případě se bavíme o transflexi.
• ATR, využívající germaniový krystal, je široce preferovaná metoda pro mnoho aplikací, díky své univerzálnosti, minimální přípravě vzorku a vysokému prostorovému rozlišení. Při ATR prochází světlo krystalem, který je přitisknut k povrchu vzorku. Světlo interaguje s prvními několika mikrometry vzorku a vrací se přes krystal zpátky do přístroje, kde je zachyceno detektorem. Aby se zabránilo poškození krystalu, je nutné, aby byly vzorky ploché a hladké. Obecně je nutné u metody ATR dosáhnout rovnoměrné síly přítlaku krystalu na vzorek. Je to z důvodu, aby se více měření provádělo za co nejvíc uniformních podmínek. Výhodou mikroskopu LUMOS II v této oblasti je hned několik. ATR krystal je zabudován přímo do objektivu, ze kterého jej lze v případě potřeby vysunout nebo zasunout a je ovládán softwarově. Mimo měření je tak křehký krystal chráněn před poškozením při případné manipulaci s objektivem nebo vzorkem ve vzorkovacím prostoru. V objektivu je taky umístněné přítlakové čidlo, které zabezpečuje optimální přítlak krystalu na vzorek.

Uvnitř FT-IR mikroskopu

Během pozorování vzorku mikroskopem je zvolena a nasnímána oblast, která je podrobená FT-IR analýze pomocí ATR, transmise nebo reflexe.  Než však IR světlo dosáhne detektoru, je posláno přes aperturu, která zajistí, aby se k detektoru dostalo pouze světlo odpovídající oblasti zájmu a je odstíněno světlo z okolí. Výsledné infračervené spektrum poskytuje podrobné chemické informace, přičemž počítačový software automatizuje identifikaci chemismu v oblasti vzorku, která nás zajímá. 

Detektory pro FT-IR mikroskopii 

V infračervených mikroskopech se běžně používají dvě hlavní kategorie detektorů: jednoprvkové detektory a tzv. imagingové neboli plošné detektory. Chemickému imagingu se budeme věnovat v odstavci níž. Nejprve se zaměříme na první kategorii, tedy jednoprvkové detektory, konkrétně DLaTGS, TE-MCT a LN-MCT.

Detektory DLaTGS (Deuterated Lanthanum α-Alanine doped TriGlycine Sulphate) mají široký spektrální rozsah a jsou uživatelsky přívětivé, protože nevyžadují chlazení. Jsou rozšířené v některých aplikacích, mohou mít však těžkosti s malými vzorky nebo úzkými aperturami.

Pro menší vzorky se nabízejí chlazené detektory z teluridu rtuťnatého a kadmiového (MCT). Citlivost těchto detektorů se odvíjí od intenzity jejich chlazení. Běžné jsou proto dva typy chlazení – termoelektrické chlazení (TE-MCT) a chlazení dusíkem (LN-MCT). Pro vzorky pod 100 µm je používán TE-MCT, který nevyžaduje údržbu a ani kapalní dusík, protože je nepřetržitě chlazen pomocí Peltierova článku. TE-MCT detektory jsou relativně nové komponenty ve světě FTIR mikroskopie, ale již nyní si našly své pevné msto pro velké množství aplikací, díky pohodlnosti ovládání při zachování slušné výkonnosti. MCT chlazené kapalným dusíkem (LN-MCT) jsou ideální pro vzorky o velikosti 20 µm nebo menší, ale vyžadují čas na chlazení a průběžné doplňování kapalného dusíku při dlouhodobém používaní.

Obr. Srovnání spekter z TE-MCT, DTGS a MCT detektoru za stejných exp. podmínek

FTIR Imaging

Pro vytváření infračervených snímku celých ploch (=chemických map) v relativně krátkém čase hrají klíčovou roli specializované detektory. Populární jsou FPA (focal plane array) detektory čítající i více než 16 tis. detektorových elementů, které mohou v rámci zorného pole zachytit více FT-IR spekter současně, proto dokážou skenovat větší plochu naráz. Tyto detektory mají v chemickém zobrazování skvělé výsledky díky své přesnosti.